Een COA leren lezen

Een COA is een meting, geen keurmerk

Bij een partij synthetische peptiden hoort in de regel een Certificate of Analysis, afgekort COA. Dat document wordt vaak gelezen als een stempel van goedkeuring, maar dat is het niet. Een COA is het verslag van een aantal metingen aan één productiepartij, uitgevoerd op één moment, door één laboratorium. Wat er staat is precies zo veel waard als de metingen die erachter zitten, en niets meer.

Voor onderzoek is dat onderscheid belangrijk. Een peptide is geen stof met een vaste identiteit die vanzelf klopt: synthese levert naast het gewenste product altijd verwante verbindingen op, zoals sequenties waarin een aminozuur ontbreekt of waarin een beschermgroep is achtergebleven. De vraag is dus niet of er iets in de vial zit, maar wat er in zit en in welke verhouding. Een COA beantwoordt die vraag met drie metingen die elkaar aanvullen: een chromatografische zuiverheidsbepaling, een massabepaling en een endotoxinebepaling.

De HPLC-trace: zuiverheid als oppervlakte

De bekendste regel op een COA is het zuiverheidspercentage. Dat getal komt vrijwel altijd uit RP-HPLC, omgekeerde-fase-vloeistofchromatografie. Een monster wordt over een kolom gestuurd waarop componenten verschillend lang blijven hangen, afhankelijk van hun hydrofobiciteit. Wat er aan het eind van de kolom uit komt, passeert een detector, meestal een UV-detector rond 214 of 220 nanometer, de golflengte waarbij de peptidebinding zelf absorbeert.

Het resultaat is een chromatogram: een lijn met pieken, waarbij elke piek een component is en de retentietijd op de horizontale as aangeeft wanneer die component van de kolom kwam. De zuiverheid wordt berekend als de oppervlakte van de hoofdpiek gedeeld door de totale oppervlakte van alle pieken. "99,4%" betekent dus: van al het materiaal dat de detector heeft gezien, hoorde 99,4 procent bij één component.

Twee dingen zijn daarbij van belang bij het lezen van de trace zelf, en niet alleen van het getal eronder. Ten eerste is een percentage een verhouding en geen hoeveelheid: het zegt niets over het aantal milligram in de vial. Ten tweede meet een UV-detector alleen wat bij die golflengte absorbeert. Zouten, restanten oplosmiddel en water dragen niet of nauwelijks bij aan het chromatogram en verschijnen dus ook niet in het percentage. Een hoge HPLC-zuiverheid en een afwijkende massa in de vial kunnen daarom naast elkaar bestaan.

De vorm van de pieken is het tweede leesbare deel. Een smalle, symmetrische hoofdpiek met een vlakke basislijn wijst op een schone scheiding. Een brede piek, een schouder aan de flank of een reeks kleine pieken vlak naast de hoofdpiek wijst op verwante verbindingen die maar net van het hoofdproduct gescheiden worden. De richtlijnen voor het valideren van dit soort analytische methoden zijn vastgelegd in ICH Q2(R2).

Massaspectrometrie: het juiste molecuul

HPLC laat zien hoe zuiver een monster is, maar niet welk molecuul is gemeten. Twee peptiden met een vergelijkbare hydrofobiciteit geven een vergelijkbare retentietijd. Daarom staat op een COA doorgaans ook een massaspectrometrische bepaling, afgekort MS.

Massaspectrometrie ioniseert de moleculen in het monster en meet hun massa-ladingsverhouding. De uitkomst wordt vergeleken met de theoretische monoisotopische of gemiddelde massa die uit de aminozuursequentie volgt. Komt de gemeten massa binnen de meetonzekerheid overeen, dan is de identiteit bevestigd. Wijkt hij af, dan zegt de richting van die afwijking iets over de oorzaak: een tekort dat overeenkomt met de massa van één aminozuur wijst op een deletiesequentie, een overschot van 42 dalton op een achtergebleven acetylgroep.

Voor peptiden wordt vaak ook de kwantiteit langs deze weg of via een aparte bepaling vastgesteld: hoeveel milligram peptide de vial werkelijk bevat, tegenover wat op het etiket staat. Dat is de meting die de blinde vlek van de HPLC-zuiverheid opvult.

Endotoxinen: de derde meting

De derde standaardregel op een COA is de endotoxinebepaling, uitgedrukt in endotoxine-eenheden per milligram (EU/mg). Endotoxinen zijn lipopolysachariden uit de buitenmembraan van gramnegatieve bacterien. Ze zijn hittestabiel en blijven achter nadat de bacterie zelf is gedood, waardoor sterilisatie alleen ze niet verwijdert.

De bepaling zelf staat beschreven in de farmacopees, in Europa als algemeen hoofdstuk 2.6.14 en in de Verenigde Staten als hoofdstuk 85. Klassiek gebeurt dat met een LAL-test, waarbij een reagens uit het bloed van de degenkrab in aanwezigheid van endotoxine stolt; er bestaan inmiddels ook recombinante varianten. Voor een onderzoeksmonster is deze waarde vooral een indicator van de netheid van de synthese, de zuivering en het vullen: hoge endotoxinewaarden wijzen op besmetting ergens in dat traject.

Het batch-ID: waar het rapport aan vastzit

Een COA zonder koppeling aan een fysieke partij is niet te controleren. Die koppeling is het batch- of lotnummer: het identificeert de productiepartij waaruit het geteste monster komt. Alleen als de verkoper duidelijk maakt bij welke partij een rapport hoort, gaat dat rapport over het materiaal dat daadwerkelijk geleverd wordt.

Bij externe laboratoria die peptide-analyses uitvoeren, waarvan Janoshik Analytical in dit veld de bekendste is, krijgt elk rapport bovendien een eigen opdracht- of taaknummer. Dat nummer is bij het laboratorium zelf op te vragen, los van de partij die het monster heeft ingestuurd. Het verschil tussen een afbeelding van een rapport en een rapport dat bij de bron te openen is, is precies dat: bij het eerste is de opsteller de enige bron, bij het tweede niet.

Een paar controles die daar logisch uit volgen:

• Klopt de koppeling: maakt de verkoper duidelijk bij welke partij of welk product het rapport hoort.
• Klopt de peptidenaam op het rapport met de sequentie waarvan de massa is bevestigd, en niet alleen met het etiket.
• Klopt de datum: een rapport hoort bij de partij die is geleverd, niet bij een eerdere partij van dezelfde stof.
• Staan alle drie de metingen erop, of alleen de zuiverheid.

Wat een COA niet vertelt

Een COA beschrijft een monster, geen protocol. Het zegt niets over de stabiliteit van het materiaal na verloop van tijd, niets over het gedrag na reconstitutie en niets over de geschiktheid voor een specifieke onderzoeksopzet. De algemene werkwijze rond oplossen, aliquoteren en opslag staat in peptiden reconstitueren; de achtergrond bij de chemie van deze stofklasse in wat zijn peptiden.

Wat een COA wel doet, is een controleerbaar feit in de plaats stellen van een mededeling. Dat is bescheiden, en het is precies genoeg: in een veld waarin de kwaliteitsverschillen tussen partijen groot zijn, is een meting aan de geleverde batch het enige wat een aanname vervangt. De gepubliceerde rapporten per product, van Retatrutide tot Ipamorelin, staan bij elkaar op de lab-testing-pagina.